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原代培養(yǎng)是指由體內(nèi)取出組織或細(xì)胞進(jìn)行的首-次培養(yǎng)，也叫初代培養(yǎng)，是細(xì)胞系建立的第一步。
在9月22日開播的“原代細(xì)胞常見問題解決方案"課程中，有很多老師就原代細(xì)胞培養(yǎng)問題提出了疑問。我們篩選出部分代表性問題，并作了詳細(xì)解答。
臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞需要包被嗎？選用什么包被比較好？
臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞建議包被，建議選用0.1%明膠包被，包被的細(xì)胞形態(tài)會(huì)比不包被的好看。
角質(zhì)細(xì)胞需要包被嗎？
角質(zhì)細(xì)胞生長類似上皮細(xì)胞，營養(yǎng)環(huán)境要求高，建議使用膠原蛋白包被。
細(xì)胞原皿狀態(tài)很好，傳代后細(xì)胞邊界不清楚是什么原因？感覺虛化的很快。
傳代后邊界不清晰，考慮細(xì)胞是否需要外基質(zhì)條件，嘗試包被培養(yǎng)瓶；其次考慮細(xì)胞是否老化、分化。
請(qǐng)問真菌污染了怎么辦？就丟了這瓶細(xì)胞嗎？
真菌污染細(xì)胞，建議丟棄，避免對(duì)其他細(xì)胞造成交叉污染，損失更大；若要挽救，建議隔離培養(yǎng)，加兩性-霉素B等抗生素，每天換液，持續(xù)清除，但只能維持幾周，后續(xù)培養(yǎng)會(huì)反復(fù)爆發(fā)，耗費(fèi)成本更高。
支原體污染會(huì)改變細(xì)胞的形狀嗎？細(xì)胞里面也有很多小碎片，這該怎么辦？用抗支原體藥可以去除細(xì)胞外碎片，但是細(xì)胞里的無變化。
污染較輕的，不會(huì)影響細(xì)胞狀態(tài)，出現(xiàn)大量碎片，細(xì)胞內(nèi)部也有碎片，污染就很嚴(yán)重了，支原體清除試劑對(duì)外部清除有效，內(nèi)部較難清除；同時(shí)在細(xì)胞內(nèi)部已損傷情況下，沒有必要清除，此時(shí)細(xì)胞已經(jīng)喪失很多功能，建議廢棄。
肝細(xì)胞培養(yǎng)中包被對(duì)其影響大嗎？
肝細(xì)胞營養(yǎng)環(huán)境要求較高，建議包被，不包被影響貼壁率（低于50%），長時(shí)間培養(yǎng)不包被會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞卷曲聚團(tuán)，影響狀態(tài)。
原代人牙周膜細(xì)胞凍存復(fù)蘇后貼壁很少且生長很慢，怎么處理呢？
原代細(xì)胞復(fù)蘇貼壁少，生長慢，首先是調(diào)整細(xì)胞密度保持在70%以上，確保生長狀態(tài)，其次選用高質(zhì)量血清或培養(yǎng)基進(jìn)行補(bǔ)救，也可以補(bǔ)加5%血清。
小鼠原代雪旺細(xì)胞傳代后不增殖怎么辦？
一般建議：
1
靜置培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞在穩(wěn)定環(huán)境下更易生長，一般3-5天可有變化；
2
調(diào)整細(xì)胞密度，控制在70%-80%，更利于細(xì)胞生長；
3
補(bǔ)加適量血清促進(jìn)細(xì)胞增殖，或更換質(zhì)量更高的血清，提高營養(yǎng)因子促進(jìn)細(xì)胞生長。雪旺細(xì)胞分離初期1-2周是處于停止增殖狀態(tài)的，度過該時(shí)期才會(huì)增殖。
原代細(xì)胞的紅細(xì)胞較多怎么辦？需要紅細(xì)胞裂解液嗎？
分離初期紅細(xì)胞較多，可用淋巴細(xì)胞分離液或Percoll分離液分離，也可用裂解液處理。
原代分離肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，酶消化法和貼壁法，哪個(gè)更好呢？
貼壁法細(xì)胞爬出慢，周期長，成功率不高耗費(fèi)時(shí)間，得到的細(xì)胞活性相對(duì)高；消化法，速度快，數(shù)量多，剛分離的活性差一點(diǎn)，后期培養(yǎng)要適應(yīng)，看自主需求選擇。
干細(xì)胞傳代次數(shù)有限制嗎？
理論上無傳代次數(shù)限制，實(shí)際培養(yǎng)中，受離體培養(yǎng)環(huán)境變化、血清質(zhì)量、培養(yǎng)基質(zhì)量、傳代損傷等外部培養(yǎng)環(huán)境影響，細(xì)胞超過10代以上會(huì)出現(xiàn)分化、不增殖、老化凋亡等問題，所以常規(guī)建議10代以內(nèi)使用。
我們?nèi)〉墓趋兰⌒l(wèi)星細(xì)胞，在大皿養(yǎng)沒事，一換液就漂，是啥原因？
骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，本身貼壁性不強(qiáng)，易漂浮，特別是局部密度大會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞聚集成束，最后分化形成肌管束，建議培養(yǎng)中均勻接種，包被增強(qiáng)吸附性，控制密度在70-80%。
脂肪細(xì)胞原代培養(yǎng)分離細(xì)胞時(shí)，沒有細(xì)胞怎么辦？
脂肪細(xì)胞原代培養(yǎng)沒分出細(xì)胞，一是要檢查分離方法是否正確，中間每一步操作最好進(jìn)行鏡檢，可以找出是哪一步損失細(xì)胞的，二是考慮后面離心步驟是否損失細(xì)胞，細(xì)胞包含脂滴，密度較小，漂浮丟棄了也有可能。
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