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雞卵泡顆粒細胞分離、培養(yǎng)實驗步驟

更新時間:2022-04-07  |  點擊率:2057
  雞卵泡顆粒細胞分離、培養(yǎng)實驗步驟:
 
  A. 翅下靜脈注射2mL EDTA-2Na(W/V,2%)溶液處死母雞,新潔爾滅消毒液浸泡消毒5min,打開腹腔,剪取整個卵巢,小心剝離卵泡(以8-15g為最佳),置于裝有PBS緩沖液的無菌培養(yǎng)皿中;
 
  B. 用加有雙抗的PBS緩沖液沖去血污,漂洗3次;將漂洗干凈的卵泡移入裝有預冷PBS緩沖液的平皿中,剝凈卵泡外膜、結締組織及血管網(wǎng);
 
  C. 用手術刀在卵泡表面劃一道1-2cm長的切口(動作要快),釋放卵黃,用PBS緩沖液將剩余的卵黃液漂洗干凈,剩下的卵泡膜即為:基膜和卵泡顆粒細胞層;
 
  D. 將漂洗干凈的卵泡膜盡量剪碎,置于15mL離心管中,加4mL培養(yǎng)基,用1mL移液槍反復吹打1min,自然沉降5min,收集上清液備用;
 
  E. 向離心管內(nèi)加入4mL 0.2%Ⅱ型膠原酶,重懸沉淀,置于37℃恒溫水浴鍋中消化30min,每5min震蕩一次;
 
  F. 消化結束,加入4mL M199*培養(yǎng)基(含10%血清)終止消化;用200目不銹鋼篩過濾,收集濾液,1200rpm離心5min;
 
  G. 沉淀用M199洗2次,室溫離心,1200rpm,5min;棄上清,加入M199*培養(yǎng)基(含5%FBS及1%雙抗)重懸后接種于6孔塑料培養(yǎng)皿,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng);12-24h后換液,隨后每天觀察,2-3天換液一次,待雞卵泡顆粒細胞生長融合用于實驗。
 
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